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ASMS2020赛默飞线上预热讲座集锦第四期:生物大分子表征新技术

2020/6/22提供者: 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 人气指数:71 进入该公司展台

 ASMS2020赛默飞线上预热讲座集锦第四期:生物大分子表征新技术

飞飞 赛默飞Orbitrap组学俱乐部 今天

关注我们,更多干货惊喜好礼001.jpg

 

全球疫情并不能停止分析科学家们技术交流与分享,61-12日,全球质谱界盛会—第68届美国质谱年会,在线上盛大举行。在此之前,赛默飞举办了线上预热讲座,内容涵盖LC-MS新产品,以及蛋白组学、生物制药、代谢组学等应用方向,所有内容现在仍可通过注册进行线上观看。

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前三期,与大家分享了新仪器的应用,蛋白组学的新技术与热点,zui后这期与大家分享讲座中的生物大分子表征新技术



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多样化液相串联质谱技术用于完整分子量表征

 

近年来,随着非变性质谱技术的日趋成熟,生物大分子完整分子量表征方法的多样性也随之增加,如色谱及电泳技术与质谱联用等方法。

 

非变性质谱进行完整分子量分析的主要优势包括:

1色谱高通用性;

2分析速度快且样品使用量小;

3质谱的高分辨性能及出色的峰容量可获得高质量质谱图。

 

非变性质谱已被注册送体验金官网界快速接受,作为完整水平的质量属性监测强有力的分析方法。此外,非变性质谱也能够在表征实验室与QC实验室之间建立强大的关联。本讲座介绍了完整分子量分析的技术重点及方法的稳健性,包括不同质谱平台间方法转换对数据的影响(从Q Exactive plusExploris 480)。

 

赛默飞完整分子量分析平台包括Vanquish Duo双三元超高效液相、Exploris 480超高分辨质谱、变色龙数据管理系统,及Protein Metrics数据分析软件。

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.赛默飞完整分子量分析平台(点击查看大图)

 

01

 

SEC平台

在线SEC-MS作为简单且稳健的分析平台,可实现高通量生物大分子聚集体分析。Vanquish Duo液相平台可以使用两根色谱柱同时进行分析和再平衡,当一根色谱柱在分析时,另一根色谱柱在平衡,可以zui大程度节约分析时间,提高分析通量。

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.Vanquish Duo实现高通量分析(点击查看大图)

 

经过液相分离得到的每个色谱峰经过质谱检测,能够获得对应的单体及聚体的分子量及糖型信息。同时,orbitrap的超高分辨性能可实现每个糖型的基线分离,在非变性条件下得到更准确的分子量信息。方法稳健性的测试,连续进样413次,每24次进一针参比品,17针参比品的色谱叠加图显示保留时间及色谱峰的RSD值在3%以内。不同实验室使用不同批次SEC色谱柱,多次技术重复实现结果显示,单体及聚体的糖型含量保持一致,具有良好的重现性。

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.非变性质谱平台的稳健性(点击查看大图)

 

02

质谱平台转移

将非变性质谱平台从QE Plus转移至Exploris 480上,并做了方法验证和对比。Exploris 48045K分辨率时,可在保证高信噪比的同时实现zui好的分辨率,能够分辨相差25Da的两个糖基化修饰峰,可作为Exploris 480分析完整蛋白时zui合适的分辨率。上样量从1ug10ug递增,谱图均有良好的信噪比,且糖型相对含量一致。

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.Exploris 480分辨率和上样量参数优化(点击查看大图)

 

QE PlusExploris 480的质谱数据(多样本且技术重复)对比显示,在完整水平上鉴定的糖型及含量高度一致,证实了方法转移的可行性(如下图所示)。

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.QE PlusExploris 480数据对比(点击查看大图)

 

03

 

CIEX平台

通过使用可挥发性盐流动相及PH梯度分离,可实现在线CIEX-MS分析,如下图a所示,对于多种单抗混合样品,可获得良好的色谱分离及高质量质谱数据(可分辨相差几十Da的糖化修饰峰)。稳定性实验中,通过CIEX-MS分析,能够观测到碱性峰中的琥珀酰亚胺中间体产物的增加(图b);加速稳定性实验中,能够观测到抗体片段的变化(图c)。

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a.CIEX-MS分析多种单抗混合物(点击查看大图)

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b.CIEX-MS分析抗体稳定性实验中的碱性峰变化(点击查看大图)

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c.CIEX-MS分析抗体加速稳定性实验中的片段峰变化(点击查看大图)



总结

 

生物大分子完整分子量分析在注册送体验金官网界已是一种广泛认可的分析方法,多样性的前端液相串联质谱(如反相,离子交换,体积排阻色谱等)平台已被开用应用。基于orbitrap的质谱平台能够获得更高分辨及稳健性的数据,且能够在不同orbitrap质谱型号间进行方法转换。对于完整蛋白糖型表征,抗体片段分析,琥珀酰胺化修饰、氧化修饰等杂质能够进行高通量且准确分析。

 

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PRCR技术与MS3在抗体Middle-down蛋白分析中的应用

 

ASMS 2019,赛默飞重磅推出三合一系列的创新dian峰之作——Thermo Scientific Orbitrap Eclipse™质谱仪,独有的PTCR技术可通过气相的离子-离子相互作用,将蛋白质的质子转移给特定的化合物(C₁₄F₂₄),从而造成蛋白质本身电荷减少,得到一系列的电荷减少离子。

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采用Middle-down质谱分析减少了样品前处理操作,降低了人为引入翻译后修饰的风险,可以更好的获取抗体的序列信息。结合使用PTCR技术后,通过降低母离子和/或子离子的价态,帮助解析复杂的MSMSⁿ谱图,可检测到更多的母离子及碎片,对结构生物学以及生物制药的应用大有助益。

讲座中简要介绍PTCR技术结合MS3SPS同步母离子扫描技术在Middle-down蛋白分析中的应用。PTCRMS3分析策略如下,方法设置中shou选会用四极杆选择某一价态的母离子,随后根据方法设置按照不同的碎裂模式,如ETDHCDUVPD进行二级碎裂,产生的碎片离子与PTCR离子发生三级反应,zui终获得的碎片离子进入Orbitrap进行质量分析。

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NIST mAb为例,进行middle-down分析前,先使用Ides酶对单抗进行酶切,然后将单抗还原成LCFdFc三条分子量约为25kDa的亚基。以分子量zui大的Fd的序列覆盖结果为例,单独使用ETDFd序列覆盖度为52%ETD碎裂模式结合PTCR-MS3可以将序列覆盖度提高至63%,同时使用PTCR后对于分子量大于5kDa的碎片识别率有了显著的提高。

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PTCRHCD碎裂模式联合使用时,同样也会提高鉴定效率。以Fd为例,PTCR-MS3虽然只是略微增加了Fd的序列覆盖度,但是互补离子对的数量有了显著增加,从0对增加到了7对。结合两者的数据可以将序列覆盖度增加到41.6%,同时互补离子对增加到8对。

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PTCRUVPD联合使用时,可以将LC的序列覆盖度从64.6%提高至74%。将单用UVPDPTCR联用的结果整合,则可以将LC的序列覆盖度提高至84.4%,互补离子对的数量也有了显著增加。

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常规的PTCR-MS3分析会将二级碎片按照质荷比进行分段,成为两个质谱分析方法,分多针进样分析。为了减少进样数量,在一针方法里实现多段质量轴的二级碎片的PTCR反应,可结合SPS同步母离子扫描技术。UVPD碎裂为例,将SPS窗口设置为目标质量范围,实现一针进样,多段分子量的PTCR分析。

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SPS结果显示,优化了PTCRUVPD反应时长后,可以实现LC 54%的序列覆盖,虽然不及多针进样模式下的结果,但仍然可以看出SPS技术应用在PTCR分析中,减少进样数量、缩短进样时间的可能性。

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总结

Eclipse上独有的PTCR(质子转移电荷减少)技术可以将蛋白上的质子转移给特定离子,简化蛋白分析中原本十分复杂的质谱图。联合PTCR与其他碎裂模式(ETDHCDUVPD),使二级碎片与PTCR离子发生三级反应,降低碎片谱图的复杂程度,可增加抗体蛋白middle-down分析的序列覆盖度。

学习使人快乐,通过四期的分享,希望大家都能从中获得快乐。

 

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标签:Exploris  480  超高分辨质谱  

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