欢迎来到 阿仪网

免费注册

首页 | 产品 | 求购 | 资讯 | 专题 | 找厂商 | 打听 | 人才 | 品牌 | 资料 | 技术文献 | 展会 | 耗材 | 配件 | 新品 | 促销 | 书籍 | 招标 | 优质仪器

您的位置: 首页 >技术文献 >技术交流 >单细胞测序前的3大关键问题,您都处理对了吗?

单细胞测序前的3大关键问题,您都处理对了吗?

提供者:上海远慕生物科技有限公司   发布时间:2020/1/2  阅读次数:97次   进入该公司展台

在无数实战经验中,制备高质量的单细胞悬液被公认为重中之重。实验过程中,如单细胞活性不高,细胞数过低,以及污染和杂质等问题,都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等,最终得到的单细胞数据分析及结果不可信。

那么,组织如何解离?需要选什么酶?还需要注意什么?远慕生物根据相关权威文献整理了单细胞悬液制备的方法和小贴士,让我们一起来解决单细胞研究方案中的拦路虎。

实体组织解离关键——酶的合理选择

实体组织解离两大步骤,包含机械分离和酶消化处理。

首先,组织需要通过物理切割或刀片切碎,然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间不同,相关建议可参考如下表格:人和小鼠的部分组织类型——肝脏、肺、皮肤、脾脏、消化道、胰腺、肾脏、视网膜等。

表1 人鼠各类型组织酶解单细胞悬液方法总结[1]

除此之外,常用酶的类型还包括:Accutase™、弹性蛋白酶和胶原酶,以及商业酶混合物,如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等。

血液处理成关键——离心稳定操作[1]

样品经过密度离心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技术),可以直接用于外周血单核细胞(PBMC)捕获[1]。

建议不少于5mL EDTA 抗凝血,且不要使用肝素抗凝管收集血液;同时注意在合适转数离心操作后,管中内容物分为三层,上层为血浆(内含细胞碎片),中间层为分层液,底层为红细胞,在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单核细胞层( 白膜层,薄)。此时,需使用无菌吸管小心沿离心管壁周缘吸取界面层单核细胞后,再加入HBSS /PBS重悬。更多注意事项请参见华大科技单细胞送样建议。

单细胞悬液制备的8条建议[1]

1. 建议采用无菌样品处理方式,包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。

2. 为降低对细胞的损伤,移液和离心应保持在最低程度。在一定的离心速度、时间和温度下,细胞浓度和大小直接影响制备的效率。

3. 在进行细胞清洗和重悬过程中,使用具有合适大小的器皿,避免高浓度导致细胞集聚和结块,请注意选择。

4. 应使用适当大小的细胞过滤器过滤悬浮液,孔径大于细胞直径,以去除团块和碎片。

5. 细胞清洗和复苏,推荐使用含牛血清的磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁),减少细胞损失和聚集的白蛋白。

6. 细胞裂解升高可导致细胞团块形成,在细胞分离过程中,DNase I可减少细胞团块形成。

7. 细胞团块会导致自动细胞计数器低估单个细胞的有效浓度,因此制备后应尽快处理悬浮液,最好在30分钟内处理。

8. 总之,在单细胞制备中,尽可能减少细胞聚集物、死亡细胞、非细胞核酸和逆转录(RT)抑制剂是非常重要的。为了在最大限度地提高不同细胞类型的纯度和无偏回收率的同时,最小化这些污染物,可能需要应用优化,例如,调整洗涤步骤的数量、洗涤溶液的组成、离心条件和/或过滤器类型。

 

优质商品

X射线荧光光谱仪
X射线荧光光谱仪

旗下频道

色谱仪 光谱仪 反应釜 试验箱 试验机 搅拌器 培养箱 离心机 水分测定 气体检测 量热仪 石油仪器 纯水器 比表面仪 温度记录 流量计 万用表 显微镜 粒度仪 测厚仪 硬度计 酸度计 元素分析 生物试剂 电线电缆 天平衡器 传感器 食品检测 压力仪表 电化学 测厚仪 阀门仪表 电力仪表 干燥设备 药物检测

注册即领取38元体验金